PRÁCTICA 15: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE COLESTEROL

08.01.2020

OBJETIVO

Determinar de forma cuantitativa la cantidad de colesterol presente en una muestra de suero de paciente.

El colesterol presente en la muestra origina un compuesto coloreado según la reacción siguiente:

 Ésteres colesterol + H 2 O CHE Colesterol + Ácidos grasos

 Colesterol + O 2 CHOD 4-Colestenona + H2O2

 2 H 2 O 2 +Fenol + 4-Aminofenazona POD Quinonimina + 4H2O

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de colesterol presente en la muestra ensayada.

FUNDAMENTO

El colesterol es una sustancia grasa presente en todas las células del organismo. El hígado produce naturalmente todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas hormonas. La determinación del colesterol es una de las herramientas más importantes para el diagnóstico y clasificación de las lipemias. El aumento del nivel de colesterol es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Material necesario:

• Espectrofotómetro
• Cubetas de espectrofotometría
• Micropipeta de 10 μL y de 1000 μL
• Tubos de ensayo
• Gradillas
• Baño termostático.

Reactivos:

• R1: Tampón
• R2: Enzimas 
• Cgikesterol Cal (patrón primario acuoso de colesterol)

Muestra:

• Suero heparinizado o EDTA. (usamos la misma muestra que en la práctica anterior de los triglicéridos)

PROCEDIMIENTO

Lo primero es encender el baño para que alcance la temperatura deseada cuando vayamos a incubar y también se enciende el espectrofotómetro y lo ajustamos a la longitud de onda que nos da el protocolo, que es de 505 nm. 
NOTA: Esto es lo que se debe hacer pero como habíamos realizado previamente la práctica de triglicéridos esto ya lo teníamos hecho, además se trabaja con la misma longitud de onda.

Luego mezclamos el vial R2 con el de R1 para de esta forma crear nuestro reactivo de trabajo (RT).
NOTA: Esto es lo que se debe hacer pero ya lo realizó previamente otro grupo de clase, por lo que ya empezamos con el RT directamente.

Seguidamente colocamos tubos de ensayo en una gradilla y rotulamos con B (blanco), P (patrón) y los otros con las iniciales de cada persona (que es la muestra).

Tras ello dispensamos 1 mL de RT en cada uno de los tubos.

Luego pipeteamos en el tubo P  10 μL de patrón Cal. Y luego cada uno pipetea 10 μL de suero de paciente en cada uno de sus tubos y homogeneiza.

Una vez realizado eso se incubó 5 minutos a 37ºC en el baño.

Cuando terminó el tiempo pasamos el contenido de los tubos a cubetas de espectrofotometría y primero ajustamos el blanco, luego calculamos la absorbancia del patrón que fue de 0.422 y por último la muestra que en mi caso fue de 0.384.

Absorbancia patrón

Con estos datos obtenemos el resultado a través de la siguiente fórmula:

(Amuestra/Apatrón) x 200

(0.384/0.422) x 200= 181.99 mg/dL

Podemos ver que entra dentro de los valores normales, ya que los valores de referencia son los siguientes:

•  Normal: Menos de 200 mg/dL
• Moderado: 200 - 239 mg/dL
• Alto: > 240 mg/dL

Tras esto podemos concluir que como los valores de referencia son los siguientes dicha muestra es patológica, ya que tiene una concentración alta de triglicéridos.

• Hombres: 40 - 160 mg/dL
• Mujeres: 35 - 135 mg/dL