PRÁCTICA 6. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GLUCOSA. HEXOKINASA
23.10.19
OBJETIVO
Obtener una medida cuantitativa de glucosa ustilizando la técnica de la hexokinasa (HK)
FUNDAMENTO
La hexokinasa cataliza las fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6-fosfato. Esta es reducida a 6-fosfogluconato en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa con reducción paralela de NAD a NADH.
Se producirá un aumento de la concentración de NADH en el medio es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada.
La glucosa es la mayor fuente de energía para las células del organismo y la insulina facilita su entrada en las células.
Material necesario:
Reactivos:
PROCEDIMIENTO
Primero encendemos el espectrofotómetro y pasado un rato poner la longitud de onda correspondiente que en este caso son 340 nm.
Preparación del RT
Preparar el reactivo de trabajo (RT) para ello: disolvemos el contenido del R2 en un frasco de R1 pero antes echar un poco del R1 (previa agitación) en el R2 y homogeneizar un poco. Seguidamente verter esto en el R1 y homogeneizar.
Preparación de blanco, patrón y muestras
Hacemos un blanco y patrón por mesa y luego una muestra por persona.
Para el blanco echamos 1 mL de RT con una micropipeta en un tubo de ensayo.
Luego echamos en otro tubo 1 mL de RT y 10 µL de calibrador Cal para hacer el patrón.
Primero cogemos el blanco y mientras lo ponemos en el baño 5 minutos.
Una vez transcurrido el tiempo lo cogemos, y ajustamos el blanco en el espectrofotómetro.
Acto seguido ponemos 5 minutos en el baño al patrón y pasado ese tiempo homogeneizamos y proceder a la lectura en el espectrofotómetro.
Anotamos la observancia que fue de 0.370.
Seguidamente pasamos a realizar las muestras, que consistió en echar en un tubo de ensayo 1 mL de RT y 10 μL de orina. Y procedemos igualmente a incubar 5 minutos en el baño a 37ºC. Transcurrido ese tiempo también se anotó la observancia que fue de 0.748
Seguidamente usamos la siguiente fórmula, ya utilizada en prácticas anteriores:
Concentración muestra/ Concentración patrón) x 100 = (0.748/0.370)x100 = 202.16 mg/dL
NOTA: Como ya hicimos en prácticas anteriores el valor del blanco se quita de la fórmula por que al ajustarlo ya nos lo resta el aparato.
OBSERVACIONES:
OBJETIVO
Obtener una medida cuantitativa de glucosa ustilizando la técnica de la hexokinasa (HK)
FUNDAMENTO
La hexokinasa cataliza las fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6-fosfato. Esta es reducida a 6-fosfogluconato en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa con reducción paralela de NAD a NADH.
Se producirá un aumento de la concentración de NADH en el medio es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada.
La glucosa es la mayor fuente de energía para las células del organismo y la insulina facilita su entrada en las células.
Material necesario:
- Micropipeta y puntas
- Vaso de desechos
- Gradilla
- Tubos de ensayo y tapones
- Baño termostato
- Espectrofotómetro
Reactivos:
- R1 y R2 (R1 es un tampón y R2 son enzimas) para formar RT (reactivo de trabajo)
- Muestra de orina
- Calibrador de glucosa
PROCEDIMIENTO
Primero encendemos el espectrofotómetro y pasado un rato poner la longitud de onda correspondiente que en este caso son 340 nm.
Preparación del RT
Preparar el reactivo de trabajo (RT) para ello: disolvemos el contenido del R2 en un frasco de R1 pero antes echar un poco del R1 (previa agitación) en el R2 y homogeneizar un poco. Seguidamente verter esto en el R1 y homogeneizar.
Preparación de blanco, patrón y muestras
Hacemos un blanco y patrón por mesa y luego una muestra por persona.
Para el blanco echamos 1 mL de RT con una micropipeta en un tubo de ensayo.
Luego echamos en otro tubo 1 mL de RT y 10 µL de calibrador Cal para hacer el patrón.
Primero cogemos el blanco y mientras lo ponemos en el baño 5 minutos.
Una vez transcurrido el tiempo lo cogemos, y ajustamos el blanco en el espectrofotómetro.
Acto seguido ponemos 5 minutos en el baño al patrón y pasado ese tiempo homogeneizamos y proceder a la lectura en el espectrofotómetro.
Anotamos la observancia que fue de 0.370.
Seguidamente pasamos a realizar las muestras, que consistió en echar en un tubo de ensayo 1 mL de RT y 10 μL de orina. Y procedemos igualmente a incubar 5 minutos en el baño a 37ºC. Transcurrido ese tiempo también se anotó la observancia que fue de 0.748
Seguidamente usamos la siguiente fórmula, ya utilizada en prácticas anteriores:
Concentración muestra/ Concentración patrón) x 100 = (0.748/0.370)x100 = 202.16 mg/dL
NOTA: Como ya hicimos en prácticas anteriores el valor del blanco se quita de la fórmula por que al ajustarlo ya nos lo resta el aparato.
OBSERVACIONES:
- En esta técnica es super importante el tiempo y debe ser de 5 minutos, el hecho de tardar más tiempo nos llevaría a resultados incorrectos, por lo que nos fuimos turnando entre compañeros por turnos de 3 minutos para no coincidir nunca en el espectrofotómetro y así poder realizar unas mediciones precisas.
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