PRÁCTICA 13: INMUNODOTTING
18.12.19
OBJETIVO
Detectar en suero humano un auto-Ac tipo IgM o tipo IgG antimitocondriales dirigidos contra determinados Ags
FUNDAMENTO
Se basa en el principio de enzimoinmunoanalisis. Cada tira está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico, en la cual se dispensan los Ags. Si los sueros contienen los auto-Acs buscados se unirán al correspondiente Ag de los fijados en la membrana.
Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se ha unido al Ag.
El conjugado se une a los complejos Ag-Ac.
Después se realiza un segundo lavado para eliminar el exceso de conjugado, se añade un sustrato que contiene la enzima ALP, desarrollará una coloración púrpura. El color tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra
Material necesario:
Matraz erlenmeyer
Micropipeta y puntas
Reactivos:
Tampón de lavado concentrado 10x
Tiras dot: 24 unidades
Tampón de dilución: tampón amarillo
Conjugado
Sustrato
Bandejas de incubación
PROCEDIMIENTO
Primero realizamos una dilución de tampón al 1/10, con un volumen final de 400 mL y lo ponemos en un matraz erlenmeyer.
Luego colocamos una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.
Luego se añaden 2 mL de tampón de lavado en cada canal que hemos usado. Se incuba 10 minutos en agitación. Vimos quetras ello los puntos azules desaparecen
Seguidamente se elimina el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y se seca el borde con papel absorbente
Luego se añade 1,5mL de tampón de dilución en cada uno de los canales.
Tras ello se añade 10 uL de muestra del paciente por canal y se incuba 30 minutos en agitación.
NOTA: es importante no tocar la membrana con la punta de las pipetas. Se debe dispensar sobre la parte superior de la tira.
Luego se elimina el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja
Tras ello se lavó dos veces con 1,5 mL de tampón de lavado. Desues de cada uno invertir la bandeja.
Añadimos 1,5 mL del conjugado por canal utilizado. Y se incuba 30 minutos en agitación.
Luego se eliminó el líquido de nuevo invirtiendo la bandeja.
Se lava dos veces cada canal con 1,5 mL de tampón de lavado, eliminando con pipeta pasteur.
Tras ello añadimos 1,5 mL de sustrato por canal e incubamos 10 minutos. Se elimina el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
Por último extraemos las tiras de los canales y las secamos en papel absorbente.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
Despegamos el adhesivo y colocamos las tiras boca arriba, basándonos en la interpretación obtenemos que la muestra es negativa ya que para el Ac específico la intensidad del punto correspondiente a su Ag era menor que la intensidad de color del control negativo.
Nos basamos en esto porque el punto superior es el control positivo y debe aparecer coloreado en todos los pacientes, esto nos asegura que los resultados son válidos.
El control negativo es incoloro, la aparición de un punto indica uniones inespecíficas debido a otras sustancias capaces de interferir. En nuestro caso no apareció
Por lo que podemos deducir que la prueba se realizó correctamente y el resultado es negativo.
OBJETIVO
Detectar en suero humano un auto-Ac tipo IgM o tipo IgG antimitocondriales dirigidos contra determinados Ags
FUNDAMENTO
Se basa en el principio de enzimoinmunoanalisis. Cada tira está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico, en la cual se dispensan los Ags. Si los sueros contienen los auto-Acs buscados se unirán al correspondiente Ag de los fijados en la membrana.
Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se ha unido al Ag.
El conjugado se une a los complejos Ag-Ac.
Después se realiza un segundo lavado para eliminar el exceso de conjugado, se añade un sustrato que contiene la enzima ALP, desarrollará una coloración púrpura. El color tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra
Material necesario:
Matraz erlenmeyer
Micropipeta y puntas
Reactivos:
Tampón de lavado concentrado 10x
Tiras dot: 24 unidades
Tampón de dilución: tampón amarillo
Conjugado
Sustrato
Bandejas de incubación
PROCEDIMIENTO
Primero realizamos una dilución de tampón al 1/10, con un volumen final de 400 mL y lo ponemos en un matraz erlenmeyer.
Luego colocamos una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.
Luego se añaden 2 mL de tampón de lavado en cada canal que hemos usado. Se incuba 10 minutos en agitación. Vimos quetras ello los puntos azules desaparecen
Seguidamente se elimina el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y se seca el borde con papel absorbente
Luego se añade 1,5mL de tampón de dilución en cada uno de los canales.
Tras ello se añade 10 uL de muestra del paciente por canal y se incuba 30 minutos en agitación.
NOTA: es importante no tocar la membrana con la punta de las pipetas. Se debe dispensar sobre la parte superior de la tira.
Luego se elimina el liquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja
Tras ello se lavó dos veces con 1,5 mL de tampón de lavado. Desues de cada uno invertir la bandeja.
Añadimos 1,5 mL del conjugado por canal utilizado. Y se incuba 30 minutos en agitación.
Luego se eliminó el líquido de nuevo invirtiendo la bandeja.
Se lava dos veces cada canal con 1,5 mL de tampón de lavado, eliminando con pipeta pasteur.
Tras ello añadimos 1,5 mL de sustrato por canal e incubamos 10 minutos. Se elimina el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja.
Por último extraemos las tiras de los canales y las secamos en papel absorbente.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.
Despegamos el adhesivo y colocamos las tiras boca arriba, basándonos en la interpretación obtenemos que la muestra es negativa ya que para el Ac específico la intensidad del punto correspondiente a su Ag era menor que la intensidad de color del control negativo.
Nos basamos en esto porque el punto superior es el control positivo y debe aparecer coloreado en todos los pacientes, esto nos asegura que los resultados son válidos.
El control negativo es incoloro, la aparición de un punto indica uniones inespecíficas debido a otras sustancias capaces de interferir. En nuestro caso no apareció
Por lo que podemos deducir que la prueba se realizó correctamente y el resultado es negativo.
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