PRACTICA 12: DETERMINACION DE HEMOGLOBINA GLICOSILADA POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
12.12.19
OBJETIVO
Cuantificar la hemoglobina glicosilada por cromatografía en columna
FUNDAMENTO
Esta práctica se basa en mezclar una alícuota de sangre completa con un agente hemolizante para obtener la lisis de os hematíes, la liberación de la Hb contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil. La fracción A1c de lahemoglbina glicosilada es separada por la Hb A1A + B mediante cromatografía de intercambio catiónico.
El porcentaje de hemoglobina se obtiene por comparación de la absorbancia del fluido con la absorbancia de la hemoglobina total.
Material necesario:
PROCEDIMIENTO
Se enciende el espectrofotómetro y se selecciona la longitud de onda que nos indica el protocolo que es de 415 nm.
1. Preparación del hemolizado
Se pipeta en un tubo eppendorf 50 µL de sangre y 450 µL de reactivo 1. Se esperaron 10 minutos.
2. Separación cromatográfica
Primero preparamos la columna quitando el tapón de la columna de cromatografía y el tapón de abajo y se desecha el conservante de la columna.
Se pipeteó 50 µL del hemolizado en el interior de la columna sobre el disco y seguidamente 2 mL del reactivo 2 (que actúa como fase movil) sobre el hemolizado. Empezará la separación quedando en el disco la hemoglobina y quedando en el tubo las Hb que no nos interesan.
Luego se cambia de tubo y se añade el R3 y en el tubo ahora quedará la Hb A1c (que es la que nos interesa).
3. Preparación de hemoglobina total
Se preparó una por clase. Se realiza con 100 µL de hemolizado y 12 mL de agua destilada. Se realiza con esta cantidad para que no supere el límite de linealidad por lo que se diluye pero luego habrá que multiplicar lo por 3.
4. Medida de la absorbancia e interpretación de resultados.
Primero ajustamos el blanco con agua destilada.
Medimos la absorbancia de la Hb total que nos dio 0,994.
Luego nuestra muestra de Hb A1c que nos dio 0,136.
Aplicando la siguiente fórmula obtenemos el porcentaje de hemoglobina glicosilada.
(AHbA1c/AHbtotal x 3) x 100
Nos dio de resultado 4,56%. Por lo que es un resultado normal para un paciente no diabético.
Debido a que los valores normales son de 4,2 - 6,2 %
OBJETIVO
Cuantificar la hemoglobina glicosilada por cromatografía en columna
FUNDAMENTO
Esta práctica se basa en mezclar una alícuota de sangre completa con un agente hemolizante para obtener la lisis de os hematíes, la liberación de la Hb contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil. La fracción A1c de lahemoglbina glicosilada es separada por la Hb A1A + B mediante cromatografía de intercambio catiónico.
El porcentaje de hemoglobina se obtiene por comparación de la absorbancia del fluido con la absorbancia de la hemoglobina total.
Material necesario:
- Tubos de ensayo de 10 mL
- Tubos eppendorf
- Gradillas
- Micropipetas y puntas
- R1: Biftalato de potasio
- R2: Tampón 42 mmol/L
- R3: Tampón 50 mmol/L
- Columna de cromatografía
NOTA: Es importante usar los reactivos y columnas del mismo lote.
Muestra: Sangre completa con EDTA
PROCEDIMIENTO
Se enciende el espectrofotómetro y se selecciona la longitud de onda que nos indica el protocolo que es de 415 nm.
1. Preparación del hemolizado
Se pipeta en un tubo eppendorf 50 µL de sangre y 450 µL de reactivo 1. Se esperaron 10 minutos.
 |
| Añadiendo R1 |
2. Separación cromatográfica
Primero preparamos la columna quitando el tapón de la columna de cromatografía y el tapón de abajo y se desecha el conservante de la columna.
Se pipeteó 50 µL del hemolizado en el interior de la columna sobre el disco y seguidamente 2 mL del reactivo 2 (que actúa como fase movil) sobre el hemolizado. Empezará la separación quedando en el disco la hemoglobina y quedando en el tubo las Hb que no nos interesan.
Luego se cambia de tubo y se añade el R3 y en el tubo ahora quedará la Hb A1c (que es la que nos interesa).
3. Preparación de hemoglobina total
Se preparó una por clase. Se realiza con 100 µL de hemolizado y 12 mL de agua destilada. Se realiza con esta cantidad para que no supere el límite de linealidad por lo que se diluye pero luego habrá que multiplicar lo por 3.
4. Medida de la absorbancia e interpretación de resultados.
Primero ajustamos el blanco con agua destilada.
Medimos la absorbancia de la Hb total que nos dio 0,994.
Luego nuestra muestra de Hb A1c que nos dio 0,136.
Aplicando la siguiente fórmula obtenemos el porcentaje de hemoglobina glicosilada.
(AHbA1c/AHbtotal x 3) x 100
Nos dio de resultado 4,56%. Por lo que es un resultado normal para un paciente no diabético.
Debido a que los valores normales son de 4,2 - 6,2 %
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