PRÁCTICA 10: IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS EN SUERO. ELECTROFORESIS

27.11.19

OBJETIVO

Con esta práctica vamos a realizar mediante técnicas electroquímicas la identificación y cuantificación de proteínas. La electroforesis es una técnica de separación de mezclas para su caracterización que se basan en la diferencia de movilidad en un campo eléctrico de las moléculas que las forman.

FUNDAMENTO

Las proteínas, moléculas anfóteras, en medio básico adquieren carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.
Como consecuencia de la migración se obtienen cinco fracciones correspondientes a diferentes proteínas plasmáticas con carga negativa decreciente:

• Albúmina (la más negativa)
• Alfa1-globulinas.
• Alfa2-globulinas.
• Beta-globulinas
• Gamma-globulinas (las más negativas)

Material necesario:

• Alimentador y cubeta de electroforesis
• Aplicador
• Tiras de acetato de celulosa
• Láminas Mylar
• Papel de filtro

Reactivos:

• Solución tampón (tris hipurato)
• Colorante Rojo Ponceau
• Decolorante rojo Ponceau (ácido cítrico al 5%)
• Solución transparentadora.
• Solución disolvente (ácido acético al 80%)

PROCEDIMIENTO

Primero disponemos el material ordenado sobre la mesa. Ya disponíamos de tiras de cellogel en 40 % de metanol, así que simplemente lo cogimos con unas pinzas. Si no las hubiésemos tenido habría que tenerlas en metanol.

Preparación del buffer

Se preparó el buffer añadiendo 100 mg de tris hipurato a 1 L de agua.

Preparación del decolorante:

Se disolvió ácido cítrico en polvo en 1 L de agua destilada y movemos un poco. Una vez realizado se vierte 500 mL en 2 cubetas. Cabe añadir que finalmente se realizaron 3 cubetas por lo que se hizo 500 mL de decolorante.

Tras estos pasos preliminares procedimos a introducir una tira (cada grupo la suya) en una cubeta con buffer. Y dos compañeros se encargaron de mover la cubeta para conseguir una agitación, durante unos 12 minutos. Mientras, otros compañeros prepararon la cámara de electroforesis, se llenó completamente un compartimento de la cámara de electroforesis y se inclina para igualar el nivel en ambos compartimentos (cabe añadir que ese tampón puede ser reutilizado dos o 3 veces, de hecho lo guardamos en esta práctica).

Transcurridos esos minutos se procedió al secado de las tiras colocándolas primero sobre un papel y poniendole otro encima para quitarle los restos de metanol y luego se pone sobre el puente con la cara absorbente hacia arriba (esto se consigue poniendo el borde cuadrado en la esquina inferior derecha) y se coloca el puente en la cámara de electroforesis.

Tras ello se aplica la muestra en la tira utilizando un aplicador, durante 10 segundos. Se debe reañozar a unos 2 cm del borde situado más cerca del polo negativo. Y se tapó la cámara de electroforesis.

Luego se seleccionó el tiempo y el voltaje. Que fue de 200 v durante 30 minutos, una vez acabado se desconecta la fuente de alimentación y se extraen las tiras.

Ahora procedimos a la tinción de la tira con Rojo Ponceau durante 5 minutos, e igualmente también se dedicaron dos compañeros a mover la cubeta. Luego con unas pinzas cada grupo fue pasando sus tiras de ahí a la solución decolorante de ácido cítrico y se aplicaron 3 baños sucesivos hasta que quedó un fondo bastante blanco. También se agitó con ayuda de dos compañeros.

(El hecho de girar es interesante porque las tiras se decoloran más rápidamente)

Transparentado: Por último se pasa la tira a una solución transparentizadora durante 1 minuto otra vez agitando. Tras ello se colocó dicha tira en un Mylar film, de tal forma que queden las muestras sobre dicha película ya que luego vamos a recortar los bordes sobrantes. Y se eliminó el exceso de solución transparentizadora con una varilla de vidrio.

Preparación del decolorante

Añadiendo buffer

Añadiendo tira

Añadiendo la tira en puente

Aplicando muestra

Realización de electroforesis

Solución colorante

Solución decolorante

Solución transparentizadora

Tiras sobre placa de vidrio

Luego fuimos con las tiras en la placa de vidrio hacia la estufa y la calentamos a 80ºC durante 10 minutos.

Cuando acabó el tiempo lo sacamos y esperamos a que se enfriase hasta una temperatura ambiente y se realizó la lectura por un fotodensitómetro.

Para ello introducimos la tira en él y seleccionamos la longitud de onde adecuada y procedemos a la lectura; el lápiz se moverá por el papel creando un gráfico (proteinograma) donde nos marca el pico de la gamma, beta... cuando lo creó nos dio un valor: 223 que corresponde a la cantidad que hay por debajo de todos esos picos, luego nos dio el primer valor (correspondiente a la albúmina) y este nos dio 92, por lo que hacemos los cálculos para saber el porcentaje, los demás valores no pudo leerlos, nos daba error.

Con una sencilla regla de 3 se puede obtener el valor: Si para 223 es el 100% para 92 es:

(92 x 100) / 223= 41.26 % de albúmina. 

Lectura de resultados