PRACTICA 7: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

24.10.19

OBJETIVO

El objetivo es realizar una separación e identificación de los aminoácidos triptófano, alanina, valina y arginina presentes en una muestra mediante una cromatografía de capa fina ascendente.

FUNDAMENTO

Esta cromatografía es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente (fase móvil) que se mueve sobre una capa delgada de un adsorbente idóneo (fase estacionaria)

Material necesario:

• Láminas de gel de celulosa
• Disolvente de cromatografía
• Disolución reveladora: se realiza resuspendiendo ninhidrina en acetona al 0,2 %.
• Muestra problema (desconocida)
• Muestra patrón de aminoácidos
• Vaso de precipitados
• Micropipeta
• Atomizador
• Estufa
  

Reactivos:

• Butanol
• Ácido acético
• Acetona
• Agua
• Ninhidrina

PROCEDIMIENTO

Lo primero que hicimos fue coger unas láminas de gel de celulosa que eran de 5 x 20 y las cortamos por la mitad para obtenerlas de 5 x10 (que era la medida que necesitábamos).

Una vez tenemos la nuestra, marcamos con un lápiz a 1,5 cm de distancia del borde una línea. Y seguidamente pintamos 2 puntos sobre esa línea, aproximadamente a 1 cm de distancia de los bordes.

Preparación del disolvente: 

Se mezcló los siguientes compuestos en estas cantidades

•  Butanol: 200 mL
• Agua: 50 mL
• Acetona: 50 mL
• Acido acético: 50 mL

Seguidamente colocamos el disolvente en el vaso de precipitados a una altura de 1 cm más o menos, un poco antes de llegar a la línea que realizamos sobre la lámina.

Preparación de patrón y muestra

Ahora con ayuda de micropipeta de 5 μL dispensamos en un punto el patrón y en otro la muestra, pero solo echamos unos 2 o 3 μL. Para ello apoyamos la punta de la pipeta primero pero sin presionar el émbolo y luego presionamos el émbolo muy levemente sin vaciar todo el contenido. 

Lo pusimos a secar seguidamente unos pocos minutos en la estufa.
Y una vez seco lo que hicimos fue poner la lámina en posición vertical en el vaso de precipitados que contiene el disolvente, como quedaba bastante por debajo de la línea marcada con el lápiz añadimos un poco más con la pipeta pasteur.
Hay que dejarlo así sobre unos 20 minutos por lo que mientras realizamos el siguiente paso.

Preparación de disolución reveladora

Para ello pesamos 0,2 gramos de ninhidrina en la balanza y vertemos sobre una probeta 100 mL de acetona y mezclamos.
Con ayuda de un embudo lo vertimos a un atomizador que posteriormente usaríamos.

Pasado ese tiempo lo que hicimos fue marcar con un lápiz hasta donde había ascendido el disolvente por capilaridad y seguidamente salimos a la calle y con el atomizador cubrimos la parte de la lámina donde está el patrón y muestras con el disolvente.
Seguidamente las metimos en la estufa unos dos minutos a 110ºC.

Tras sacarla de la estufa pudimos comprobar que se había coloreado en el lado del patrón con 3 marcas y en el lado de la muestra con una.

Realización de calculos:

Con la siguiente fórmula 

Rf= distancia recorrida por el compuesto desde el origen (cm)/ distancia recorrida por el eluyente desde el origen (cm)

Las medidas fueron las siguientes

distancia recorrida eluyente: 3,9 cm
distancia recorrida marca 1 (centro): 1.2
distancia recorrida marca 2 (centro): 2.3
distancia recorrida marca 3 (centro): 2.9

Realizamos la fórmula y los resultados fueron:

Rf = 1.2/3,9 = 0.308
Rf = 2.3/3.9 = 0.6
Rf= 2.9/3.9= 0.74

Estas característica nos permite mediante la comparación con patrones, la identificación de una sustancia en una mezcla.

Viendo la lámina podemos ver que la muestra problema se corresponde con la segunda marca que es de ácido glutámico.

OBSERVACIONES:

_Tanto el disolvente como la disolución reguladora solo lo realizó un grupo de la clase, con lo que fue suficiente.
_ La pulverización con ninhidrina debe realizarse en la calle o cerca de una ventana para que así se evite el exceso de pulverización, o también se puede en una campana de seguridad. Es muy importante no inhalar el pulverizado.