PRÁCTICA 4: CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN ORINA CON ÁCIDO SULFOSALICÍLICO POR TURBIDIMETRÍA

DÍA 1 (14.10.19)

OBJETIVO

El objetivo de esta práctica es aprender la técnica de turbidimetría, la cuál es una de las variantes de la espectrofotometría de dispersión.

FUNDAMENTO:

La adición de ácido sulfosalicílico a una solución de proteínas actúa sobre estas, dando lugar a la aparición de un fino precipitado en suspensión. Este precipitado se observa como una turbidez blanquecina cuya intensidad puede ser cuantificada por turbidimetría
Basándonos en esto vamos a cuantificar la concentración de proteínas presentes en una muestra de orina.

Material necesario:

• Tubos de ensayo (10 mL)
• Pipetas automáticas con capacidades de 25,50,100,200,400)
• Cubetas de fotometría
• Fotómetro.
• Matraz aforado
• Vidrio de reloj
• Embudo
  

Reactivos:

• Suero salino fisiológico (0,9 g/dL)
• Ácido sulfosalicílico al 3% (p/v) en agua destilada
• Patrón de proteínas (7 g/dL)
• Albúmina bovina

Muestra:

• Orina centrifugada ( 5 minutos a 2000 rpm). Usar el sobrenadante, también puede usarse orina no centrifugada.

PROCEDIMIENTO

1. Este día solo realizamos la batería y el ácido sulfalicílico

Para la batería lo que hicimos fue poner 4 tubos de ensayo en una gradilla y con ayuda de una pipeta graduada pusimos 10 mL de solución salina en cada uno de ellos (los tubos fueron rotulados del 1 al 4)

Seguidamente quitamos del tubo 1 : 50 µL.

                                             tubo 2: 100 µL.

                                             tubo 3: 200 µL.

                                             tubo 4: 400 µL.

Depositando 10 mL de solución salina

Quitando las cantidades pertinentes de solución salina

2. Tras todo esto echamos las mismas cantidades en cada tubo de patrón de proteínas con ayuda de micropipetas.

Por ejemplo del tubo 1 pusimos 50 µL de patrón de proteínas y así sucesivamente.

Tras acabar los tapamos con tapones y los guardamos.

3. Realización del ácido

Para ello pesamos en la balanza 3 gramos de ácido sulfosalicílico en un vidrio de reloj

Cogimos un matraz aforado, un embudo y un dispensador de agua

Así primero echamos un poco de agua en el matraz, luego ponemos el embudo y vertemos el contenido del vidrio de reloj, y lo limpiamos para que no quedaran restos con agua destilada, dejandolo caer al matraz, y también le echamos agua al embudo.

Una vez echado todo el contenido, enrasamos el matraz hasta los 100 mL, para ello llenamos hasta cerca de la línea de enrase, y luego echamos gota a gota con una pipeta pasteur hasta llegar a la línea de enrase, siempre poniéndolo a la altura de los ojos.

Movemos un poco. Y lo trasvasamos a un tarro de plástico con tapa de rosca. Y además rotulamos que era y la fecha. (Muy importante cuando se manipulan productos químicos) 

Lo guardamos junto a la batería.

DÍA 2: 16.10.19

Este día preparamos los dos blancos y preparamos cuatro tubos más de patrón y un último tubo como muestra problema. Para ello:

1. Repartimos la orina en contenedores estériles para toda la clase.

2.  Disponemos en una gradilla los tubos y los rotulamos correctamente antes de empezar. Seguidamente echamos en el de BR (blanco reactivo) 0,5 mL de suero salino fisiológico, y 2 mL de ácido sulfosalicílico. Luego en los patrones echamos en el p1 (patrón 1) 0,5 mL de D1 y 2 mL de ácido sulfosalicílico, en el P2 serían 0,5 de D2 y 2 de ácido y así sucesivamente hasta el tubo p4.
Seguidamente en el BM (blanco de muestra) echamos 2 mL de suero salino fisiológico y 0,5 mL de orina. Y por último echamos 0,5 mL de orina y 2 de ácido en la muestra problema.

Además al realizar esto hemos hecho una dilución al 1/5 por lo que las concentraciones varían, obteniéndose las siguientes:

Iniciales:                     Finales:

280 mg/dL                  56 mg/dL
140 mg/dL                  28 mg/dL
70 mg/dL                    14 mg/dL
35 mg/dL                    7 mg/dL

NOTA: Se usan dos blancos debido a que como no vamos a centrifugar la orina tendrá un color, y los patrones que hemos realizado no lo tienen, por lo que tendremos que realizar un blanco para los patrones y otro para la muestra.

3. Para realizar las mediciones y que nos fuese más cómodo y rápido usamos micropipetas.

Cuando acabamos los tapamos con tapones y agitamos suavemente

Micropipeta y solución salina

Patrones

NOTA: Como el ácido es precipitante, hay que moverlo y seguidamente realizar las lecturas.

LECTURA:

Seleccionamos el fotómetro a 660 nm y procedimos de la siguiente forma:

Primero ajustamos a cero con el blanco de reactivo (BR)
Luego medimos la absorbancia de los tubos P1, P2, P3 y P4.
Ajustamos a cero de nuevo pero con el blanco de muestra (BM)
Medimos la absorbancia de la muestra problema

Absorbancia P1

Absorbancia P1

Absorbancia de la muestra problema

Tras ello, fuimos anotando resultados, procedimos a realizar una gráfica (curva de calibración) en excell para calcular la concentración a partir de la gráfica, también se puede realizar en el espectrofotómetro pero debido a que somos muchos en clase y había grupos a la espera procedimos a hacerlo en el ordenador.

RESULTADOS:
                                         Cabe recordar las concentraciones:
P1: 1.541                          56 mg/dL
P2: 0.940                          28 mg/dL
P3: 0.359                          14 mg/dL
P4: 0.051                          7 mg/dL

PB: 0.586

OBSERVACIONES

Como el resultado del P4 fue tan bajo, volvimos a ajustar el blanco de reactivo y volvimos a realizar la medición, pero salió el mismo resultado, por lo que para la gráfica despreciamos ese resultado.

GRÁFICA Y CÁLCULO DE CONCENTRACIÓN

Como podemos ver hemos obtenido la ecuación que sería y=0,028x + 0,0234. Como la y corresponde a la absorbancia, solo nos queda despejar para calcular la concentración de la muestra problema.

0,586 = 0,028x + 0,0234
0,586 - 0.0234 = 0.028x
x = 20.09 mg/dL