PRÁCTICA 1: CONSTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN Y MANEJO DEL ESPECTROFOTÓMETRO

21.09.19

OBJETIVO:

El objetivo de esta práctica es comprender el funcionamiento de la espectrofotometría de absorción mediante el estudio de la luz que emite gracias a las técnicas de espectrofotometría, para ello debemos realizar varios pasos, entre ellos crear una batería de dilución (que aprendimos a hacerla en el curso anterior) porque con ella, vamos a ver como cambia la absorción debido a que cada dilución tiene una concentración distinta

PARTE 1: BATERIA DE DILUCIÓN

Material necesario:

• Erlenmeyer con cromógeno 1, de concentración 800 mg/dL
• Erlenmeyer con cromógeno 2, de concentración 600 mg/dL
• Agua destilada
• Pipetas manuales y automáticas
• Tubos de ensayo
• Cubetas de espectrofotometría
• Espectrofotómetro de absorción

Material necesario para la batería de dilución

PROCEDIMIENTO:

Preparemos dos baterías de dilución:

La primera fue de 5 tubos de 4 mL ccada uno y un factor de dilución 1/2, y la segunda consta de 4 tubos con 3 mL cada uno y un factor de dilución 1/3. El primer tubo de cada batería se construyó con el colorante procedente del Erlenmeyer sin diluir, es decir el tubo de disolución madre (P.D. este tubo no se incluye en el numero de tubos que hemos dicho anteriormente)

Para preparar ambas baterías, cogimos los dos Erlenmeyer con el cromógeno, para la primera batería, pusimos 4 mL de agua (disolvente) en cada tubo y cogimos 4 mL con una pipeta y lo pusimos en el primer tubo, luego se homogeneizó y después se vuelven a coger 4 mL y se pone en el segundo tubo, y así hasta el final. NOTA: al final quitemos 4 mL para que se queden todos los tubos al mismo nivel pero cabe resaltar que quitar esos 4 mL no afecta a la concentración, de igual forma a la disolución madre le pusimos inicialmente 8 mL para que también quedase al mismo nivel, esto fue así porque tras realizar los cálculos nos dio el volumen de paso 4 mL, por lo que había que poner el volumen final y el de paso para que quedase a la misma altura.

De igual forma lo hicimos con la otra batería pero con otros volúmenes, ya que el volumen final es de 3 mL y el de paso nos dio 1,5 mL por lo que en la disolución madre inicialmente pusimos 4,5 mL y en el ultimo tubo retiramos 1,5 mL

CALCULOS:

Estos fueron los cálculos realizados

OBSERVACIONES: 

Podemos ver como varía el color según va disminuyendo la concentración, por lo que a simple vista parece estar bien, aunque en el color azul la variación ya es muy tenue en los dos últimos a nuestros ojos por lo que se confirmaría una vez usamos el espectrofotómetro.

PARTE 2: USO DEL ESPECTOFOTÓMETRO

Tras haber realizado la batería el último día, el siguiente día de clase lo dedicamos a medir las longitud de onda correspondiente al color azul. Para ello realizamos los siguientes pasos:

1. Encendemos el espectrofotómetro
2. Encendemos el ordenador
3. Seleccionamos la opción deseada, que en nuestro caso fue medir la absorbancia del cromógeno azul. Y esperar un minuto y medio para que haga un chequeo.
4. Pinchamos en parámetros y no modificamos datos
5. Se establece entre 340-700 nm para ver todo el espectro.
6. Llenamos la cubeta con el colorante (de disolución madre) y la colocamos correctamente en el espectrofotómetro. Cabe añadir que es importante limpiar las cubetas por fuera antes de introducirlas para evitar huellas que produzcan interferencias y mediciones erróneas, además de poner sobre el haz de luz la cara que no es opaca. Además cabe recordar que el haz de luz en este espectrofotómetro va de derecha a izquierda
7. Tras ello nos apareció una curva en una ventana
8. Y finalmente seleccionamos la opción de picos altos para indicarnos el pico de máxima absorbancia, que nos dio 662 nm

Pico más alto obtenido: 662 nm

Seguidamente fuimos a otro espectrofotómetro que hay en el laboratorio y procedimos a medir la absorbancia de cada uno de los tubos de la batería azul, para posteriormente realizar una curva de calibración. El funcionamiento de este espectrofotómetro es el siguiente:

•  Conectar a la corriente y encender (en este no hace falta dejarlo unos minutos de chequeo)
• Seleccionar absorbancia y monocromática
• Seleccionar la longitud de onda más cercana, que como ya sabemos nos ha dado 662 nm, pues la opción más cercana era 670 nm así que seleccionamos esa.
• Seleccionamos el volumen de muestra (siempre 400 mL en este aparato)
• Metimos el blanco, que era agua destilada, ya que es la que actuó como disolvente en nuestra batería de diluciones.

A continuación, tras finalizar el blanco, dispusimos las gradillas con los tubos de ensayo al lado para tenerlo a mano y ordenadas las cubetas y fuimos anotando resultados.

Para realizar las mediciones, empezamos con el tubo de disolución madre , primero lo homogeneizamos un poco con leves movimientos y se vierte un poco en la cubeta y poniéndola con las precauciones y forma que hemos mencionado antes, dio una absorbancia de 0,912, los resultados fueron los siguientes: (se adjunta tabla):

IMÁGENES

Al próximo día de clase realizamos la misma operación pero con la batería de dilución de color rojo.
Como el pico más alto que se obtuvo fue de 499 nm, se realizaron las mediciones con 500 nm (ya que es el valor más cercano), además cabe añadir que utilizamos en esta ocasión otro espectrofotómetro para familiarizarnos con todos los del aula.
Procedimos de la misma forma que con la batería azul, estos fueron los resultados de absorbancia; además ya también realizamos la gráfica de resultados.

IMÁGENES:



MANEJO DEL ESPECTROFOTÓMETRO. CÁLCULO DE UNA CONCENTRACIÓN DESCONOCIDA.

Queremos calcular la concentración de dos colorantes (azul y rojo) cuya concentración es desconocida, para ello vamos a proceder de la misma manera que en las prácticas anteriores, de forma que ya no ajustamos el blanco porque ya estaba puesto de diluciones anteriores, y como es el mismo disolvente no hacía falta.
Como íbamos a empezar con el rojo tampoco hubo que cambiar la longitud de onda.
Primero vertemos la dilución en tubos de ensayo para que sea más cómodo y posteriormente homogeneizamos un poco y la pasamos a la cubeta, siempre con las precauciones de no tocar demasiado y limpiarla bien, metemos la cubeta en su soporte y cerramos, para el rojo os salió una absorbancia de 1,427.
Luego con el rojo, le dimos a seleccionar longitud de onda y le pusimos 662 nm, cogimos la cubeta y pusimos en el soporte y medimos (no hace falta el blanco porque es el mismo), y nos dio un resultado de 0,588.
Tras ello realizamos las gráficas y siguiendo la ley de Lambert Beer sabemos que la concentración es lineal a la absorbancia, solo teniendo estos datos de absorbancia podemos calcular la concentración y los resultados fueron los siguientes:

•  Azul: 1050 mg/dL
• Rojo: 115 mg/dL