PRÁCTICA 11: CUANTIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA DESCONOCIDA POR INMUNODIFUSIÓN RADIAL

04.12.19

OBJETIVO

El objetivo va a ser cuantificar los niveles de proteínas sanguíneas desconocidos.

FUNDAMENTO

La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa muy sensible que se usa para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas de los pacientes.

Material necesario:

• Placa de Petri pequeña
• Micropipetas y puntas
• 10 cortadores para pocillos (well cutters)
• Microondas
• Baño termostático
• Probeta de 200 mL 
• Matraz aforado de 150 mL
• Estufa de incubación

Reactivos

• Solución de Ac.
• Solución de Ag estándar.
• Agarosa
• Tampón en polvo
• Proteína de concentración desconocida

PROCEDIMIENTO

1. Preparación del tampón

Un grupo de clase preparó el tampón, para ello se vertió 200 mL de agua destilada en una probeta y se vertió a un matraz erlenmeyer, luego se vertió el componente D (buffer) sobre el agua y se mezcló bien con una varilla.

2. Preparación de agarosa

Otro grupo de clase preparó la agarosa, para ello se empleó 150 mL de tampón el cual se midió con un matraz aforado y sobre el con ayuda de un embudo se vierte el componente C (agarosa). Seguidamente se metió dos minutos al microondas y vimos que ya estaba transparente, por lo que la sacamos y lo metimos en el baño (previamente puesto a 50ºC). Una vez que la agarosa estuvo lista se vertieron 26 mL en un recipiente y se le añadió el componente A (Ac).

3. Batería de dilución

Mientras tanto cada grupo disponia de su tubo E ( que contiene Ag estándar), su tubo D (Ag desonocido) y el tubo T (que contiene tampón). Proseguimos a realizar la batería con factor de dilución 2, por lo que las respectivas diluciones serán 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16.

Primero echamos en los tubos 50 µL de tampón en cada uno. Tras ello:

En el tubo 1/2 depositamos 50 µL del tubo E, homogeneizamos y pasamos 50 µL al tubo 1/4 y así hasta el último donde se desecha el último volumen de paso. Es importante cambiar de punta en cada tubo.

4. Perforación pocillos.

Cuando tuvimos la agarosa lista se pipeteó con una micropipeta de 3000 µL la agarosa en la placa de Petri y se dejó solidificar (es importante que no queden burbujas de aire por lo que se pueden romper con una punta de pipeta cuidadosamente)

Una vez se solidificó realizamos los pocillos con un well cutters pero vimos que no era tan fácil quitar la agarosa para formar el pocillo por lo que los otros pocillos lo realizamos con pipeta pasteur para pinchar y seguidamente absorber.

Usamos como plantilla la placa pintada en un papel para saber la distancia de los pocillos, además rotulamos por el lado de la placa y por fuera los números correspondientes a cada pocillo, y la rotulamos también correctamente con nuestro grupo.

5. Carga de patrones y muestra

Cuando realizamos la carga hicimos lo siguiente: primero se puso 5 µL del Ag desconocido en el pocillo central

Luego echamos 5 µL de cada tubo en los pocillos periféricos.

Tapamos la placa y la ponemos en cámara húmeda con las demás durante 1 semana (aunque es suficiente con 48 horas).

6. Lectura de resultados

Los anillos de precipitación son visibles de 24 a 48 horas. Nosotros lo miramos a la semana y con ayuda de un contador de colonias con una regla medimos los halos de los pocillos. Hubo uno, el pocillo 3, que no apareció halo por lo que lo descartamos. Los resultados fueron los siguientes (diámetro del halo en mm y al cuadrado):

_ Pocillo 1: 400 mm
_ Pocillo 2: 225 mm
_ Pocillo 4: 64 mm
_ Pocillo 5: 49 mm
_ Pocillo muestra: 130 mm

Las concentraciones eran:

_ Pocillo 1: 2 mg/mL
_ Pocillo 2: 1 mg/mL
_ Pocillo 4:  0,25 mg/mL
_ Pocillo 5: 0,125 mg/mL

La concentración del pocillo de la muestra lo podemos calcular realizando una curva de calibración con los resultados obtenidos y de esta forma podemos calcularlo extrapolando con la gráfica o realizando la ecuación de la gráfica que nos da excell y despejamos el resultado.

2ª PARTE

También realizamos ese dia una inmunodifusión con unas placas ya preparadas llamadas EASY RID.

En esta práctica utilizamos estas placas que ya vienen preparadas con la agarosa lista y con IgG (verde) IgM (azul) e IgA (rojo).

Dispensamos en los pocillos 5 uL de suero. Y ponemos nuestro nombre en el lateral de la placa, una vez listas las dejamos reposar 20 minutos y tras ello, le damos la vuelta la metemos en el sobre y lo dejamos así 48 horas

Varios días después realizamos la lectura de los resultados de forma que medimos en mm con ayuda de una regla el diámetro de los halos. En mi caso fueron 6 mm, y como se encontraba en la zona de color rojo que corresponde a la IgA, con esos dos datos nos vamos a la tabla que tenemos en nuestro protocolo y obtenemos la concentración.
La concentración corresponde a: 210 mg/dL